兔白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒操作技术步骤

阅读次数：2334    发布时间：2015/10/29 13:57:40

本试剂仅供研究

ELISA试剂盒实验样本：用于测定兔血清，血浆及相关液体检测

液体样本。

实验原理：

兔白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔白细胞介素1β（IL-1β）水平。用纯化的兔白细胞介素1β抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白细胞介素1β，再与HRP标记的羊抗兔抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-1β呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中兔白细胞介素1β（IL-1β）浓度。

兔白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒组成：

试剂盒组成48孔配置96孔配置保存

说明书1份1份

封板膜2片（48）2片（96）

密封袋1个1个

酶标包被板1×481×962-8℃保存

标准品：90ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/

分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞2浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为60ng/L，40ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

兔白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请*后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

兔白介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。

2.批内与批见应分别小于9%和11%

保存条件及有效期：

1.试剂盒保存：2-8℃。

2．有效期：6个月

原创作者：上海润裕生物科技有限公司