鸡促肾上腺皮质激素（ACTH）ELISA试剂盒操作步骤及原理

阅读次数：1201    发布时间：2018/1/5 20:56:12

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡促肾上腺皮质激素（ACTH）水平。用纯化的

鸡促肾上腺皮质激素（ACTH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次

加入促肾上腺皮质激素（ACTH），再与HRP标记的促肾上腺皮质激素（ACTH）抗体结合，

形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催

化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的促肾上腺皮质

激素（ACTH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线

计算样品中鸡促肾上腺皮质激素（ACTH）浓度。

标本要求

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能

马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

鸡促肾上腺皮质激素（ACTH）ELISA试剂盒操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀

释。

80ng/L5号标准品150µl的原倍标准品加入150µl标准品稀释液

40ng/L4号标准品150µl的5号标准品加入150µl标准品稀释液

20ng/L3号标准品150µl的4号标准品加入150µl标准品稀释液

10ng/L2号标准品150µl的3号标准品加入150µl标准品稀释液

5ng/L1号标准品150µl的2号标准品加入150µl标准品稀释液

2

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、

待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，

然后再加待测样品10µl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽

量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10分钟。

10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止

液后15分钟以内进行。

操作程序总结：

计算

3

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的

OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，

即为样品的实际浓度。

原创作者：上海润裕生物科技有限公司